前    言
本標準的5.1、5.3和第8章條文為強制性條款，其余為推薦性條款。
本標準的附錄A、附錄C和附錄D為規范性附錄，附錄B為資料性附錄。
　
農用微生物菌劑
1　范圍
本標準規定了農用微生物菌劑（即微生物接種劑）的術(shù)語(yǔ)和定義、產(chǎn)品分類(lèi)、要求、試驗方法、檢驗規則、包裝、標識、運輸和貯存。
本標準適用于農用微生物菌劑類(lèi)產(chǎn)品。
2　規范性引用文件（略）
3　術(shù)語(yǔ)和定義（略）
4　產(chǎn)品分類(lèi)
產(chǎn)品按劑型可分為液體、粉劑、顆粒型；按內含的微生物種類(lèi)或功能特性可分為根瘤菌菌劑、固氮菌菌劑、解磷類(lèi)微生物菌劑、硅酸鹽微生物菌劑、光合細菌菌劑、有機物料腐熟劑、促生菌劑、菌根菌劑、生物修復菌劑等。
5　要求
5.1　菌種
    生產(chǎn)用的微生物菌種應安全、有效。生產(chǎn)者應提供菌種的分類(lèi)鑒定報告，包括屬及種的學(xué)名、形態(tài)、生理生化特性及鑒定依據等完整資料。生產(chǎn)者應提供菌種安全性評價(jià)資料。采用生物工程菌，應具有允許大面積釋放的生物安全性有關(guān)批文。
5.2　產(chǎn)品外觀(guān)（略）
5.3　產(chǎn)品技術(shù)指標
5.3.1　農用微生物菌劑產(chǎn)品的技術(shù)指標見(jiàn)表1，其中有機物料腐熟劑產(chǎn)品的技術(shù)指標按表2執行。
                   表1  農用微生物菌劑產(chǎn)品的技術(shù)指標

   表2  有機物料腐熟劑產(chǎn)品的技術(shù)指標

5.3.2　農用微生物菌劑產(chǎn)品中無(wú)害化指標見(jiàn)表3。
            表3  農用微生物菌劑產(chǎn)品的無(wú)害化技術(shù)指標

6　試驗方法
6.1　儀器設備（略）
6.2　試劑（略）
6.3　產(chǎn)品參數的檢測
6.3.1　外觀(guān)(感官)的測定
取少量樣品放到白色搪瓷盤(pán)(或白色塑料調色板)中，仔細觀(guān)察樣品的顏色、形狀、質(zhì)地。
6.3.2　有效活菌數的測定
采用平板計數法，根據所測微生物的種類(lèi)選用適宜的培養基。
若采用最大可能數（Most Probable Number，MPN）5管法，遵照附錄C的規定。
6.3.2.1　系列稀釋
稱(chēng)取樣品10 g（精確到0.01 g），加入帶玻璃珠的100 mL的無(wú)菌水中(液體菌劑取l0.0 mL加入90 mL的無(wú)菌水中)，靜置20 min，在旋轉式搖床上200 r/min充分振蕩30 min，即成母液菌懸液（基礎液）。
用無(wú)菌移液管分別吸取5.0mL上述母液菌懸液加入45 mL無(wú)菌水中，按1:10進(jìn)行系列稀釋?zhuān)謩e得到1:1×101，1:1×102，1:1×103，1:1×104……稀釋的菌懸液（每個(gè)稀釋度應更換無(wú)菌移液管）。
6.3.2.2　加樣及培養
每個(gè)樣品取3個(gè)連續適宜的稀釋度，用無(wú)菌移液管分別吸取不同稀釋度菌懸液0.1 mL，加至預先制備好的固體培養基平板上，分別用無(wú)菌玻璃刮刀將不同稀釋度的菌懸液均勻地涂于瓊脂表面。
每一稀釋度重復3次，同時(shí)以無(wú)菌水作空白對照，于適宜的條件下培養。
6.3.2.3　菌落識別
根據所檢測菌種的技術(shù)資料，每個(gè)稀釋度取不同類(lèi)型的代表菌落通過(guò)涂片、染色、鏡檢等技術(shù)手段確認有效菌。當空白對照培養皿出現菌落數時(shí)，檢測結果無(wú)效，應重做。
6.3.2.4　菌落計數
以出現20~300個(gè)菌落數的稀釋度的平板為計數標準（絲狀真菌為10~150個(gè)菌落數），分別統計有效活菌數目和雜菌數目。當只有一個(gè)稀釋度，其平均菌落數在20～300個(gè)之間時(shí)，則以該平均菌落數計算。若有兩個(gè)稀釋度，其平均菌落數均在20～300個(gè)之間時(shí)，應按兩者菌落總數之比值決定。若其比值小于等于2應計算兩者的平均數；若大于2則以稀釋度小的菌落平均數計算。有效活菌數按式（1）或式（2）計算：
             nm = kv1/(m0v2) ×10-8                              …………………（1）
nv = kv1/(v0v2) ×10-8                                …………………（2）
 
式中：
nm — 質(zhì)量有效活菌數，         億/g
          nv — 體積有效活菌數，         億/mL
          — 菌落平均數，             個(gè)
k — 稀釋倍數
v1 — 基礎液體積，             mL
v2 — 菌懸液加入量，           mL
v0 — 樣品量，                 mL
m0 — 樣品量，                 g
6.3.3　霉菌雜菌數的測定
采用馬丁培養基，測定方法同6.3.2。
6.3.4　雜菌率的測定
除樣品有效菌外其它的菌均為雜菌。樣品中雜菌率按式（3）計算：
              m = n1/(n1+n)×100                              …………………（3）
式中：
m — 樣品雜菌率，             %
            n1 — 雜菌數，                億/g(mL)
            n — 有效活菌數，            億/g(mL)
6.3.5　水分的測定
將空鋁盒置于干燥箱中105 ℃±2 ℃烘干 0.5 h，冷卻后稱(chēng)量記錄空鋁盒的質(zhì)量。然后稱(chēng)取2份平行樣品（顆粒型樣品，應先粉碎過(guò)1.0 mm試驗篩），每份20 g（精確到0.01 g），分別加入鋁盒中并記錄質(zhì)量。將裝好樣品的鋁盒置于干燥箱中105 ℃±2 ℃下烘干4 h~6 h。取出置于干燥器中冷卻20 min后進(jìn)行稱(chēng)量。水分含量按式（4）計算（結果為兩次測定的平均值）：
         w = (m1- m2)/( m1- m0) ×100                    …………………（4）
式中：
w — 樣品水分含量，           %
m0 — 空鋁盒的質(zhì)量，           g
m1 — 樣品和鋁盒的質(zhì)量，       g
m2 — 烘干后樣品和鋁盒的質(zhì)量， g
6.3.6　細度的測定
6.3.6.1　粉劑樣品
稱(chēng)取樣品50 g（精確到0.1 g），放入300 mL燒杯中，加200 mL水浸泡10 min~30 min后倒入孔徑0.18 mm的試驗篩中，然后用水沖洗，并用刷子輕輕地刷篩面上的樣品，直至篩下流出清水為止。將試驗篩連同篩上樣品放入干燥箱中，在105 ℃±2 ℃烘干4 h ~6 h。冷卻后稱(chēng)量篩上樣品質(zhì)量。樣品細度按式（5）計算：
s  ={1- m1/[ m0（1-w）]} ×100                   …………………（5）
 
式中：
s  — 篩下樣品質(zhì)量分數，     %
m0  — 樣品質(zhì)量，             g
w   — 樣品含水量，           %
m1  — 篩上干樣品質(zhì)量，       g
6.3.6.2　顆粒樣品
稱(chēng)取樣品50 g（精確到0.1 g），將兩個(gè)不同孔徑的試驗篩（1.0 mm和4.75 mm）摞在一起放在底盤(pán)上(大孔徑試驗篩放在上面)。樣品倒入大孔徑試驗篩內篩樣品，然后稱(chēng)小孔徑試驗篩上的樣品質(zhì)量。顆粒細度按式（6）計算：
         g = m1 /m0 ×100                                         …………………（6）
式中：
g — 樣品質(zhì)量分數，          %
m1 — 小孔徑試驗篩上樣品質(zhì)量，g
m0 — 樣 品 質(zhì) 量，           g
6.3.7　pH值的測定
打開(kāi)酸度計電源預熱30 min，用標準溶液校準。
pH值的測定，每個(gè)樣品重復三次，計算三次的平均值。
6.3.7.1　液體樣品
用量筒取40mL樣品放入50 mL的燒杯中，直接用酸度計測定，儀器讀數穩定后記錄。
6.3.7.2　粉劑樣品
稱(chēng)取樣品15 g，放入50 mL的燒杯中，按1:2(樣品:無(wú)離子水)的比例將無(wú)離子水加到燒杯中(如果樣品含水量低，可根據基質(zhì)類(lèi)型按1:3~1:5的比例加無(wú)離子水)，攪拌均勻。然后靜置30 min，測樣品懸液的pH值，儀器讀數穩定后記錄。
6.3.7.3　顆粒樣品
樣品先研碎過(guò)1.0 mm試驗篩，按照6.3.7.2的方法測定。
6.3.8　糞大腸菌群數的測定
應符合GB/T 19524.1《肥料中糞大腸菌群的測定》的規定。
6.3.9　蛔蟲(chóng)卵死亡率的測定
應符合GB/T 19524.2《肥料中蛔蟲(chóng)卵死亡率的測定》的規定。
6.3.10　纖維素酶活、蛋白酶活的測定
應符合附錄D的規定。
6.3.11　砷、鎘、鉛、鉻、汞的測定
應符合GB 18877—2002中的5.12~5.17的規定。
6.3.12　保質(zhì)期的檢驗
在產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)標明的保質(zhì)期前，按6.3.1~6.3.11方法測定產(chǎn)品相應指標。
7　檢驗規則
本標準中產(chǎn)品技術(shù)指標的數字修約應符合GB 8170的規定；產(chǎn)品質(zhì)量合格判定應符合GB 1250中修約值比較法的規定。
7.1　抽樣
按每一發(fā)酵罐菌液（或每批固體發(fā)酵）加工成的產(chǎn)品為一批，進(jìn)行抽樣檢驗，抽樣過(guò)程嚴格避免雜菌污染。
 
7.1.1　抽樣工具
無(wú)菌塑料袋(瓶)，金屬勺、抽樣器、量筒、牛皮紙袋、膠水、抽樣封條及抽樣單等。
7.1.2　抽樣方法和數量
一般在成品庫中抽樣，采用隨機法抽取。
抽樣以件為單位，小包裝以每一包裝箱為一件。隨機抽取3~5件，每件中隨機抽取一袋(瓶)；若每袋(瓶)包裝小于500 g（mL）的產(chǎn)品，應多抽幾件。大包裝產(chǎn)品以一袋(桶)為一件，隨機抽取5~10件，在無(wú)菌條件下，每件取樣500 g(mL)，然后將抽取樣品混勻，按四分法分裝3袋(瓶)，每袋（瓶）不少于500 g(mL)。
7.2　檢驗分類(lèi)（略）
7.3　判定規則
7.3.1　具下列任何一條款者，均為合格產(chǎn)品
a. 檢驗結果各項技術(shù)指標均符合標準要求的產(chǎn)品；
b. 在產(chǎn)品的外觀(guān)、水分、細度、pH值等檢測項目中，有1項不符合要求，而其它各項技術(shù)指標符合要求的產(chǎn)品。
7.3.2　具下列任何一條款者，均為不合格產(chǎn)品
a. 有效活菌數不符合技術(shù)指標；
b. 霉菌雜菌數不符合技術(shù)指標；
c. 雜菌率不符合技術(shù)指標；
d. 糞大腸菌群不符合技術(shù)指標；
e.     蛔蟲(chóng)卵死亡率不符合技術(shù)指標；
f. 砷、鎘、鉛、鉻、汞中任一含量不符合技術(shù)指標；
g. 有機物料腐熟劑產(chǎn)品中所測酶活不符合技術(shù)指標；
h. 在外觀(guān)、水分、細度、pH值等檢測項目中，有2項（含）以上不符合要求。
8　包裝、標識、運輸和貯存
    參見(jiàn)NY 885-2004《農用微生物產(chǎn)品標識要求》

　

附　錄　A   常用檢測培養基
　
    參見(jiàn)NY/T 1114-2004《微生物肥料實(shí)驗用培養基技術(shù)條件》

　
附　錄　B
（資料性附錄）
常用染色劑
B.1　革蘭氏染色劑
B.1.1　結晶紫染色液（Hucker氏配方）
甲液：結晶紫（Crystal violet）       2.0 g
      乙醇(95%)                      20.0 mL
乙液：草酸銨[(NH4)2C2O4?H2O]             0.8g
      蒸餾水                         80.0 mL
甲、乙兩液相混，過(guò)濾，棕色瓶保存。
B.1.2　盧哥(Lugol)氏碘液
碘(I2)片                            1.0 g
碘化鉀(KI)                          2.0 g
蒸餾水                              300 mL
先溶碘化鉀于少量蒸餾水中，再將碘溶于碘化鉀溶液中，可稍加熱，最后加足蒸餾水，棕色瓶保存。
B.1.3　脫色液  95%的乙醇液。
B.1.4　復染液  0.5%的番紅水溶液（Safranin O)
2.5%的番紅酒精溶液                  20 mL
蒸餾水                              80 mL
B.2　芽胞染色液
B.2.1　孔雀綠染色液（Malachite green）
孔雀綠                             5.0 g
蒸餾水                            100 mL
B.2.2　0.5%番紅染色液
B.3　石碳酸復紅染色液
甲液：堿性復紅(Basic fuchsin)     0.3 g
       95%酒精                     10.0 mL
乙液：石碳酸(Phenoecrystals C.P)  5.0 g
       蒸餾水                      95 mL
將甲、乙兩液混合后即得石碳酸復紅染色液原液。染色時(shí)，將原液稀釋5~10倍使用。

　
附　錄　C
（規范性附錄）
稀釋法（MPN 5管法）
C.1　稀釋
稱(chēng)取樣品10.0 g，加入帶玻璃珠的100 mL的無(wú)菌水中(液體菌劑取l0.0 mL加入90 mL的無(wú)菌水中)，靜置20 min，在旋轉式搖床上200 r/min充分振蕩30 min，即得到1×101稀釋度的菌懸液。
用無(wú)菌移液管吸取5.0mL上述菌懸液加入到裝有45mL無(wú)菌水的三角瓶中，充分振蕩搖勻，得到1×102稀釋度的菌懸液，依此方法制成1×103、1×104、1×105……稀釋度的菌懸液（每個(gè)稀釋度應更換無(wú)菌移液管）。
C.2　加樣
選擇適宜的5個(gè)連續稀釋度，用無(wú)菌移液管分別吸取不同稀釋度的菌懸液1.0 mL，加到已準備好的盛有9.0 mL無(wú)菌培養基的螺口試管中，每一稀釋度重復接5支試管（不同稀釋度間更換無(wú)菌移液管），同時(shí)用無(wú)菌培養液作對照。
C.3　培養
接種后立即擰緊塑料帽并搖勻，將接種好的試管放到適宜的條件下培養。
C.4　計算
根據各稀釋系列試管中有無(wú)待測微生物生長(cháng)或其生理反應的正或負得出數量指標，并在相應的MPN統計表中查出近似值（見(jiàn)表C1），即可計算出待測樣品的有效活菌數，以?xún)|個(gè)/mL或億個(gè)/g表示。
計算方法：
1mL（g）樣品中的有效活菌數=菌數近似值×數量指標第一位數的稀釋倍數
C.5　計數規則
在稀釋系列中必須最后一個(gè)稀釋度所有重復間都沒(méi)有微生物生長(cháng)。確定數量指標系取稀釋系列中所有重復都有生長(cháng)(或是正反應)的最高稀釋度為數量指標的第一位數字，總共取三個(gè)連續稀釋管的結果查表。
C.5.1　在全部5支試管中均出現生長(cháng)的稀釋度中，把出現生長(cháng)的稀釋度倍數最高的那一級放入數列。例如：為5-5-3-0-0時(shí)，則取5-3-0數列；
C.5.2　在全部5支試管中均不出現生長(cháng)的稀釋度中，把稀釋度倍數最低的那一級放入數列。例如：為5-3-0-0-0時(shí)，則取5-3-0數列；
C.5.3　如果應用上述兩條規則，會(huì )出現采用如5-5-4-3-0這樣的4個(gè)等級的稀釋度的情況。此時(shí)，可先取前面的5-4-3數列，后取4-3-0數列，分別求出lgMPN，然后算出其真數的平均值。在此列中，數列5-4-3的lgMPN為1.447，數列4-3-0的lgMPN為0.431+1（后一數列與前一數列相應稀釋了10倍，故要加1進(jìn)行校正），（1.447+1.431）/2=1.439，所以MPN=27.5。

表C.1  MPN，lgMPN表